Berapa waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi media kultur?

Teknik kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Kultur jaringan berperan menghasilkan tanaman yang bebas virus.

Faktor pembatas dalam perbanyakan tanaman secara kultur jaringan salah satu nya adalah dengan terjadinya kontaminasi pada setiap masa dalam pada periode kultur. Kontaminasi dapat berasal dari eksplan (baik internal maupun eksternal), organisme kecil yang masuk kedalam media (seperti semut), botol kultur atau alat-alat yang kurang steril, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kurang steril (spora di udara).

Eksplan dapat terkontaminasi oleh berbagai mikroorganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Namun sumber utama kontaminasi adalah spora jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer. Banyak yang bersifat non patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal.

Kontaminasi permukaan dapat di atasi dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan pensteril. Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman.

Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofilik (organisme yang hidup didalam sel atau antar ruang antar sel tanaman) yang sering merupakan biote dari tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan sterilisasi permukaan.  Keadaan ini disebabkan oleh koloni bakteri sering tidak muncul pada saat baru dikulturkan pertama kali, tetapi beberapa minggu kemudian muncul koloni bakteri. Bateri tersebut tetap ada setelah disubkulturkan beberapakali, karena hidupnya memang secara epifit didalam jaringan tanaman.

Eksudasi dari eksplan merupakan tipe kontaminasi yang lain, bukan dari organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel disekitar luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia atau sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur.

Adapun kontaminasi yang sering terjadi pada kultur jaringan tanaman terdiri atas 2 jenis yaitu kontaminasi oleh bakteri atau kontaminasi oleh jamur. Untuk membedakan kedua jenis kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang muncul pada eksplan maupun media kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka tanaman akan basah atau menyebabkan lendir, hal ini dikarenakan bakteri langsung menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering, dan akan muncul hifa jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya garis-garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abu-abu.

Botol kultur yang terkontaminasi harus dikeluarkan dari ruangan thermostatik. Selanjutnya harus di sterilisasi menggunakan autoclave listrik. Alat ini dilengkapi dengan dengan timer dan thermostat. Sebagai sumber uap, berasal dari air yg ditambahkan kedalam autoclave dan dididihkan. Sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada temperature 121°C, selama 30 menit. Setelah itu cuci botol kontam yang telah selesai disterilisasi di autoclave dengan sabun anti bakteri, bilas hingga bersih. Langkah terakhir adalah sterilisasi kembali botol yang telah bersih di autoclave selama 10 menit. Botol kultur siap digunakan kembali.

Botol yang terkontaminasi bakteri dan jamur

Botol kontam yang telah di sterilisasi di autoclave

Pencucian botol kultur yang telah di sterilisasi

Botol yang telah di cuci di sterilisasi kembali menggunakan autoclave

Op. UPTD Agribisnis

 Anny Dufi,    21 September 2021 Media Tanam Kultur Jaringan

Oleh   : Rena Afrieska Apriliani, S.P (petugas lab. kuljar)

Editor : Anny Dufi

(volume2)

Media tanam kultur jaringan merupakan media yang diperlukan agar sel atau jaringan tanaman yang diisolasi dapat tumbuh dan berkembang menjadi  tanaman  yang  lengkap.  Media  tersebut  mempunyai  komposisi nutrien yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan  sesuai dengan yang diinginkan.  Kebutuhan  nutrisi  untuk  pertumbuhan  bahan  tanam/eksplan yang optimal sangat bervariasi antar jenis tanaman, bahkan di antara bagian tanaman yang berbeda.

Komposisi  media  tanam  kultur  jaringan  terdiri  dari  sejumlah  unsur yang  diperlukan  untuk  pertumbuhan  bahan  tanam/eksplan  dalam lingkungan buatan, dengan pengelompokan sebagai berikut :

1. Hara Makro (Macro Nutrient).
Hara makro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah banyak oleh tanaman, yaitu nitrogen (N),  phosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S).  N merupakan komponen dalam pembentukan protein dan asam amino dalam tubuh tanaman, juga merupakan elemen pada beberapa koenzim.  P merupakan komponen pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA) serta dibutuhkan sebagai sumber energi transfer.  K dibutuhkan untuk mengatur potensial osmotik sel tanaman.  Ca untuk sintesis dinding sel, fungsi membran dan berperan dalam aktifnya signal sel.   Mg merupakan kofaktor enzim dan komponen klorofil.   S adalah komponen beberapa asam amino dan beberapa kofaktor enzim. Media makro pada MS terdiri dari KNO3,  NH4NO3,  CaCl2.2H2O,  MgSO4.7H2O,  dan  KH2PO4.

2. Hara Mikro (Micro Nutrient).
Hara mikro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit oleh tanaman, yaitu ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) dan molybdenum (Mo). Fe merupakan  komponen  cytochrome  yang  berperan  dalam transfer electron. Mn adalah kofaktor enzim, Zn berperan dalam sintesis klorofil dan juga merupakan kofaktor enzim.  Co adalah komponen beberapa vitamin. Cu merupakan kofaktor enzim dan berperan dalam reaksi transfer elektron.  Mo juga merupakan kofaktor enzim dan komponen dari enzim nitrate reductase. Baik hara makro maupun hara mikro, keduanya diberikan dalam bentuk garam inorganik.

3. Myo-inositol
Myo-inositol adalah senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel pada banyak spesies tanaman. Meskipun bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan pectin.  Myo-inositol memiliki peran dalam pembelahan sel, digunakan dalam konsentrasi berkisar 50-5000 ppm.  

4. Zat pengatur tumbuh.
Umumnya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in-vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin.  ZPT golongan auksin yang biasa digunakan dalam kultur in-vitro adalah: indole-3- acetic acid (IAA), indole-3- butricacide (IBA), 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) dan naphthalene- acetic acid (NAA).   ZPT dari golongan sitokinin adalah: BA (Benzyladenine), BAP (6-benzyloaminopurine), 2- iP (isopentenyl adenine), kinetin (6-furfurylaminopurine), Zeatin (6-4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) dan TDZ (thidiazuron). Rasio kedua golongan ZPT ini akan mempengaruhi arah morfogenesis yang terjadi pada kultur.  Rasio auksin yang lebih tinggi dari sitokinin akan menstimulasi terbentuknya akar, sedangkan rasio sitokinin yang lebih tinggi dari auksin akan menginduksi terbentuknya tunas.  Jika auksin dan sitokinin pada konsentrasi yang sama (rasio 1) maka akan terbentuk kalus. Untuk pembentukan kalus juga dapat digunakan 2,4-D.  Ada beberapa jenis ZPT lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro. ZPT tersebut yaitu gibberellin (GA3) untuk pembentukan tunas pada spesies tertentu, dan asam absisik (ABA) untuk pematangan embrio pada proses embriogenesis somatik.   Dalam proses pembuatan larutan stok ZPT, untuk IAA, 2,4-D dan NAA dapat dilarutkan awal dengan beberapa tetes alkohol 95% atau NaOH 1N, sedangkan untuk golongan sitokinin umumnya digunakan beberapa tetes HCL 1N atau dimethylsulfoxide (DMSO).   Jika bahan sudah terlarut oleh pelarut awal, maka baru kemudian ditambah DD water (Double distilled water) untuk mencapai volume yang diinginkan. Penggunaan pelarut awal ini diperlukan untuk menghindari terjadinya penggumpalan akibat tidak larutnya ZPT tersebut.

5. Vitamin
Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme.  Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel serta proses diferensiasi sel dan jaringan yang ditanam secara in vitro.  Beberapa jenis vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro adalah thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine.  Diantara ketiganya, yang bersifat esensial adalah thiamin (vitamin B1) yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel tanaman.  Nicotinic acid dan pyridoxine (vitamin B6) dibutuhkan hanya oleh spesies tanaman tertentu.  Ada beberapa jenis vitamin lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro namun bersifat tidak umum atau spesifik hanya untuk kultur tertentu, yakni biotin, folic acid, ascorbic acid, pantothenic acid, tocopherol (vitamin E), riboflavin, dan p-amino- benzoic acid.

6. Gula
Jenis gula yang umum digunakan dalam kultur in vitro adalah sukrosa,  jumlahnya berkisar 2-3 % atau 20-30 gram/liter media. Selain sukrosa, beberapa jenis gula lainnya adalah laktosa, galaktosa, maltosa , glukosa dan fruktosa.  Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi karena tanaman kultur bersifat heterotroph, tidak dapat melakukan fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat.     Respirasi menghasilkan energi yang digunakan oleh sel tanaman untuk melakukan pembelahan sel. Dengan demikian gula ditambahkan pada media kultur sebagai sumber energi.

7. Asam amino
Asam  amino  tidak  selalu  harus  ditambahkan  pada  media kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas. Penggunaannya  secara  tunggal  atau  campuran  dari  beberapa asam amino.  Asam amino menyediakan sumber nitrogen untuk pertumbuhan sel. Senyawa nitrogen ini lebih mudah diserap oleh sel tanaman dibandingkan sumber nitrogen dari garam inorganik. Asam amino yang biasa digunakan adalah casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparagine, adenine, glycine, glutamine, asparagine, L-arginine, cysteine dan L-tyrosine.

8. Pemadat media
Penambahan senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat. Pemadat tersebut dapat berupa agar, agarose atau gellan gum. Agar dan agarose digunakan dalam konsentrasi 0.7-1.0% (7-10 gram per-liter media), sedangkan gellan gum 0.2-0.6% (2-6 gram per-liter media).  Gellan gum dijual dengan nama dagang Gellrite, Phytagel dan Kelcogel. Media kultur sebaiknya tidak terlalu padat agar penyerapan nutrisi dapat berjalan baik.  

Teknik Pembuatan Media Kultur
Kebutuhan media dan larutan stok diartikan sebagai kebutuhan akan jumlah bahan media dan larutan stok yang harus dipenuhi pada waktu yang diperlukan  pada  beberapa  macam/tahap  kegiatan  kultur  jaringan. Kebutuhan media ini dapat dibedakan atas kebutuhan per kegiatan kultur jaringan  per  satuan  waktu  tertentu  dan  kebutuhan  untuk  total  kegiatan kultur jaringan per satuan waktu tertentu.

Kebutuhan media ini secara rinci dihitung berdasarkan tahapan- tahapan pekerjaan yang berkaitan dengan pemakaian media, yaitu: tahap inisiasi kultur (penumbuhan awal eksplan), tahap penggandaan propagul (tergantung   frekuensi   penggandaan),   tahap   pembesaran   kultur   sampai planlet siap diaklimatisasikan.
 

Pencampuran Bahan Media Kultur Cara   mencampur bahan media untuk pembuatan media 1 liter adalah sebagai berikut : masukkan ke dalam erlenmeyer berukuran 1 liter aquades kira-kira 300 ml, larutkan gula diikuti mio-inositol kedalamnya setelah gula larut sempurna dengan diaduk secara merata. Larutan-larutan stok dimasukkan satu per satu, setelah satu bahan melarut diikuti bahan yang lainnya.. Hasil pencampuran media dituangkan dari erlenmeyer ke labu takar atau gelas ukur untuk ditepatkan volumenya menjadi 1 liter, dengan menambah aquades. Pengaturan pH Media Kultur

Kisaran nilai pH yang dipandang paling sesuai untuk kebanyakan media kultur jaringan untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan sel-sel tanaman antara 5,6-5,8. Pada nilai pH yang terlalu asam (< 4,5) agar akan terhidrolisis dan sulit membentuk gel. Nilai pH harus diatur agar tidak mengganggu membran sel dan pH sitoplasma.

Pemasakan Bahan Media Kultur
Media dalam panci dimasak pada kompor sambil diaduk-aduk  menggunakan pengaduk pada pemanas kompor. Setelah mendekati keadaan   mendidih   (sudah   mulai   keluar   titik-titik   gelembung   sebelum menjadi gelembung besar), pemanasan dihentikan.