Untuk memperbesar bayangan obyek yang diamati langkah yang dapat dilakukan adalah

Salah satu penemu sejarah mikrobiologi dengan mikroskop adalah Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723), tahun 1675 Antonie membuat mikroskop dengan kualitas lensa yang cukup baik, dengan menumpuk lebih banyak lensa sehingga dia bisa mengamati mikroorganisme yang terdapat pada air hujan yang menggenang dan air jambangan bunga, juga dari air laut dan bahan pengorekan gigi. Ia menyebut benda-benda bergerak tadi dengan ‘animalcule’. Mikroskop dapat dibedakan atas beberapa jenis, tetapi mekanisme bekerjanya pada prinsipnya sama, yaitu terdiri dari sistem optik atau sistem pembesaran, dan sistem iluminasi yang menyebabkan terlihatnya suatu objek.  Bagian-bagian mikroskop sederhana dapat dilihat pada Gambar 5.

2.1  Jenis-jenis Mikroskop

Berbagai jenis mikroskop dengan tingkat pembesaran maksimum dan ciri-ciri masing-masing dapat dilihat pada Tabel 1. Mikroskop terbagi dalam 2 jenis:

1. Mikroskop yang menggunakan sumber cahaya
2. Mikroskop yang menggunakan sumber elektron

Pada mikroskop cahaya digunakan sistem lensa dan sinar dengan pajang gelombang tertentu. Termasuk dalam jenis mikroskop ini ialah:

• Mikroskop medan terang
• Mikroskop medan gelap
• Mikroskop kontras-fase
• Mikroskop fluoresen

Mikroskop cahaya sendiri dibagi lagi menjadi dua kelompok besar, yaitu berdasarkan kegiatan pengamatan dan kerumitan kegiatan pengamatan yang dilakukan. Berdasarkan kegiatan pengamatannya, mikroskop cahaya dibedakan menjadi mikroskop diseksi untuk mengamati bagian permukaan dan mikroskop monokuler dan binokuler untuk mengamati bagian dalam sel (Gambar 6). Mikroskop monokuler merupakan mikroskop yang hanya memiliki 1 lensa okuler dan binokuler memiliki 2 lensa okuler. Berdasarkan kerumitan kegiatan pengamatan yang dilakukan, mikroskop dibagi menjadi 2 bagian, yaitu mikroskop sederhana (yang umumnya digunakan pelajar) dan mikroskop riset (mikroskop dark-field, fluoresens, fase kontras, Nomarski DIC, dan konfokal).

Gambar 6. Mikroskop Binokuler dan Monokuler

Termasuk dalam jenis mikroskop elektron ialah:

1. Mikroskop Elektron Transmisi
2. Mikroskop Elektron Skaning

Tabel 1. Perbedaan berbagai jenis mikroskop

1.    Struktur Mikroskop

Ada dua bagian utama yang umumnya menyusun mikroskop, yaitu:

1. Bagian optik, yang terdiri dari kondensor, lensa objektif, dan lensa okuler.
2. Bagian non-optik, yang terdiri dari kaki dan lengan mikroskop, diafragma, meja objek, pemutar halus dan kasar, penjepit kaca objek, dan sumber cahaya.

2.    Pembesaran 

Tujuan mikroskop cahaya dan elektron adalah menghasilkan bayangan dari benda yang di mikroskop lebih besar. Pembesaran ini tergantung pada berbagai faktor, diantaranya titik fokus kedua lensa (objektif f1 dan okuler f2, panjang tubulus atau jarak (t) lensa objektif terhadap lensa okuler dan yang ketiga adalah jarak pandang mata normal (sn) (Gambar 7). Lensa objektif bekerja mengatur fokus sinar lampu pada objek yang ditempatkan dibelakang titik fokal F1 dan memperbesar objek sehingga menghasilkan bayangan nyata yang diproyeksikan pada bidang fokal dari lensa okuler. Bayangan nyata yang terletak di depan titik fokal F1 dari lensa okuler diperbesar oleh lensa okuler sehingga membentuk bayangan maya. Dengan demikian, total pembesaran merupakan hasil dari pembesaran lensa objektif dan lensa okuler. Lensa objektif terdiri dari kombinasi lensa konveks dan lensa konkaf.

Gambar 7. Bagian-bagian mikroskop sederhana

Untuk memperoleh berbagai tingkat pembesaran, setiap mikroskop pada umumnya dilengkapi dengan tiga buah lensa objektif yang dipasang pada nosepiece yang dapat diputar, yaitu terdiri dari:

1. Lensa objektif berkekuatan rendah (low power, 16 mm) yang ditandai dengan angka 10x pada bagian luarnya dan mempunyai jarak kerja 5-8.3 mm.
2. Lensa objektif berkekuatan tinggi (high dry, 4 mm) yang ditandai dengan angka 40x, 43x, 44x, atau 45x, dan mempunyai jarak kerja 0.46-0.72 mm.
3. Lensa objektif minyak imersi (immersion oil, 1.8 mm) yang ditandai dengan angka 95x, 97x atau 100x dan mempunyai jarak kerja 0.13-0.14 mm.

Untuk mengatur fokus sistem lensa pada objek, digunakan dua buah knop yang dapat diputar yaitu knop pengatur kasar yang mengatur jarak antara lensa dengan objek, dan knop pengatur halus yang menggerakkan tabung penyangga lensa secara halus sehingga menghasilkan fokus yang tepat.

2.2  Mikroskop Cahaya

Mikroskop cahaya atau dikenal juga dengan nama “Compound light microscope” adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya matahari sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor. Mikroskop cahaya mempunyai perbesaran maksimum 1000 kali. Mikroskop mempunyai kaki yang berat dan kokoh dengan tujuan agar dapat berdiri dengan stabil. Mikroskop cahaya memiliki tiga sistem lensa, yaitu lensa obyektif, lensa okuler, dan kondensor. Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop. Lensa okuler pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat. Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Kondensor berperan untuk menerangi obyek dan lensa-lensa mikroskop yang lain.

2.2.1 Jenis lensa

Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa, yaitu lensa obyektif, lensa okuler, dan kondensor. Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat (Gambar 8).

 Lensa obyektif berfungsi guna pembentukan bayangan pertama dan menentukan struktur serta bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta berkemampuan untuk memperbesar bayangan obyek sehingga dapat memiliki nilai “apertura” yaitu suatu ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah. Lensa obyektif bekerja dalam pembentukan bayangan pertama. Lensa ini menentukan struktur dan bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir. Ciri penting lensa obyektif adalah memperbesar bayangan obyek dan mempunyai nilai apertura (NA). Nilai apertura adalah ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah (Gambar 9).

Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat. Lensa okuler, adalah lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung berdekatan dengan mata pengamat, dan berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa obyektif berkisar antara 4 hingga 25 kali (Gambar 10).

Gambar 10. Lensa okuler

Lensa kondensor, adalah lensa yang berfungsi guna mendukung terciptanya pencahayaan pada obyek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal. Lensa kondensor, berfungsi juga untuk mendukung terciptanya pencahayaan pada obyek yang akan difokus, sehingga bila pengaturannya tepat akan diperoleh daya pisah maksimal (Gambar 11). Jika daya pisah kurang maksimal, dua benda akan tampak menjadi satu. Perbesaran akan kurang bermanfaat jika daya pisah mikroskop kurang baik. Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Kondensor berperan untuk menerangi obyek dan lensa-lensa mikroskop yang lain.

Gambar 11. Lensa kondensor

2.2.2 Preparasi sediaan

Persiapan preparat di dalam mikroskop cahaya terbagi menjadi dua jenis, yaitu: Preparat Non-permanen, yang dapat diperoleh dengan menambahkan air pada sel hidup di atas kaca objek, kemudian diamati di bawah mikroskop.

Preparat permanen, yang dapat diperoleh dengan melakukan fiksasi yang bertujuan untuk membuat sel dapat menyerap warna, membuat sel tidak bergerak, mematikan sel, dan mengawetkannya.

Tahap selanjutnya, yaitu pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. Preparat dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan karena pada umumnya jaringan memiliki tekstur yang lunak dan mudah pecah setelah mengalami fiksasi, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun dari atom karbon yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi. Setelah dilakukan penyayatan, dilanjutkan dengan pewarnaan, yang bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Setiap pewarna mengikat molekul yang memiliki kespesifikan tertentu, contohnya: Hematoksilin, yang mampu mengikat asam amino basa (lisin dan arginin) pada berbagai protein, dan eosin, yang mampu mengikat molekul asam (DNA dan rantai samping pada aspartat dan glutamat).

Pada mikroskop konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor. Pada mikroskop modern sudah dilengkapi lampu sebagai pengganti sumber cahaya matahari.

2.3  Mikrosop Medan Gelap

Dengan mikroskop ini latar belakang terlihat gelap sedangkan mikroorganisme terlihat terang. Hal ini disebabkan suatu kondensor khusus, sehingga sebagian besar cahaya tidak masuk ke lensa obyektif. Mikroorganisme terlihat terang karena sinar cahaya yang masuk dipantulkan.

Mikroskop ini biasanya digunakan untuk melihat:

1. Preparat basah
2. Preparat tetes bergantung

2.4  Mikroskop Fluoresence

Mikroskop fluorescence hampir sama dengan mikroskop cahaya biasa dengan tambahan fitur untuk meningkatkan kemampuannya. Pada mikroskop konvensional menggunakan cahaya tampak (400 - 700 nanometer) untuk iluminasi dan menghasilkan gambar sampel yang diperbesar. Sementara mikroskop fluorescence, sebaliknya, menggunakan intensitas cahaya yang lebih tinggi, yang mengeksitasi bagian berpendar pada sampel. Mikroskop fluorescence sering digunakan untuk menggambarkan fitur khusus dari spesimen kecil seperti mikroba. Juga digunakan untuk secara visual meningkatkan fitur 3-D pada skala kecil.

Mikroskop fluorescence digunakan untuk:

-  Menampilkan komponen struktural suatu spesimen kecil, seperti sel.

-  Melakukan studi viabilitas pada populasi sel (apakah mereka hidup atau mati?)

-  Menampikan materi genetik pada sel (DNA dan RNA)

-  Melihat sel - sel spesifik dalam populasi yang lebih besar dengan teknik khusus seperti FISH

Pada mikroskop fluorescence (Gambar 12) terdapat beberapa filter yaitu:

Memantulkan semua cahaya terkecuali cahaya biru

Menahan cahaya biru, dan membolehkan cahaya hijau (atau cahaya lainnya yang dipantulkan zat warna) lalu. Barrier filter yang digunakan tergantung dari zat warna yang dipakai.

Gambar 12. Mikroskop fluorescence

2.5  Mikroskop Kotras-fase

Mikroskop kontras-fase sangat berguna untuk melihat preparat hidup. Jenis mikroskop ini dilengkapi oleh kondensor dan obyektif khusus. Penggunaan kedua macam perlengkapan ini menyebabkan kita dapat melihat preparat yang tidak diwarnai berdasarkan refraksi indeks atau ketebalannya. Jika terjadi perbedaan tebal struktur suatu sel maka akan terjadi perubahan indeks refraksi dan perubahan fase, sehingga struktur sel mikroorganisme terlihat dengan jelas.

2.6  Mikroskop elektron 

Mikroskop elektron adalah sebuah mikroskop yang mampu untuk melakukan pembesaran objek sampai 2 juta kali, yang menggunakan elektro statik dan elektro magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus daripada mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan jauh lebih banyak energi dan radiasi elektromagnetik yang lebih pendek dibandingkan mikroskop cahaya. Mikroskop elektron mempunyai dua tipe, yaitu mikroskop elektron scanning (SEM) dan mikroskop elektron transmisi (TEM). SEM digunakan untuk studi detil arsitektur permukaan sel (atau struktur renik lainnya), dan obyek diamati secara tiga dimensi (Gambar 13). Objek yang akan diamati mula-mula dilapisi dengan lapisan tipis logam berat seperti emas. Berkas elektron diarahkan pada objek dan ditatapkan (scan) bolak balik. Elektron yang disebarkan oleh logam berat tersebut dikumpulkan dan akan mengaktifkan layar untuk membentuk bayangan. Dengan alat SEM ini hanya permukaan objek yang akan dilihat, dan pembesarannya sangat bervariasi yaitu dari 15.000 sampai kira-kira 100.000 kali. Sedangkan TEM digunakan untuk mengamati struktur detil internal sel.

Gambar 13. Mikroskop elektron scanning

Kelemahan Mikroskop Elektron

1. Spesimen harus dimasukkan dalam ruang hampa udara, sehingga sel tidak dapat diperiksa dalam keadaan hidup.
2. Sewaktu pengeringan dapat terjadi kerusakan morfologi.
3. Daya merasuk yang rendah, dari berkas elektron, sehingga specimen yang diperiksa harus merupakan sayatan yang sangat tipis.
4. Gambaran mengenai struktur internal sel disesuaikan dengan jenis mikroskop lainnya, oleh karena struktur internal yang diperlihatkan mikroskop elektron berbeda dengan mikroskop lainnya. Ini berarti bahwa untuk mengerti gambaran yang diberikan oleh mikroskop elektron, diperlukan pengalaman dan keahlian.

2.7  Mengatur Besarnya Obyek

Perbesaran bayangan dari suatu obyek dapat diketahui dari angka perbesaran lensa obyektif dan lensa okuler. Ukuran suatu benda dapat diketahui dengan membandingkan terhadap ukuran bidang pandang. Hal ini dapat dikerjakan dengan beberapa langkah berikut: letakkan penggaris plastik berskala mm diatas meja obyek dan perkirakan diameter bidang pandang tersebut, dan catat perbesaran lensa obyektifnya. Ubahlah lensa obyektif dengan lensa obyektif perbesaran kuat dan tentukan diameter bidang pandangnya dengan rumus berikut:

? ok = ? ol x pl/pk

Keterangan :

?ok = diameter bidang pandang dengan obyektif perbesaran kuat.

?ol = diameter bidangpandang dengan obyektif perbesaran lemah

pk = perbesaran lensa obyektif kuat, pl = perbesaran lensa obyektif lemah

2.8  Mempersiapkan Preparat

Mikroskop merupakan alat optik yang dapat digunakan untuk mengamati benda-benda mikro (benda-benda yang sangat kecil) yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Obyek yang akan diamati atau diperbesar dengan mikroskop disebut Spesimen. Untuk membuat preparat non-permanen dilakukan beberapa langkah, yaitu letakkan medium (berupa setetes air) diatas gelas obyek, dan letakkan bahan yang akan diamati didalam medium. Selanjutnya tutuplah dengan kaca penutup. Usahakan agar tidak terdapat gelembung udara pada medium. Hal ini dapat diusahakan dengan beberapa langkah berikut: pegang kaca penutup dengan posisi 45o terhadap gelas obyek, sentuhkan tepi bawah kaca penutup pada permukaan medium dan perlahan-lahan rebahkan sehingga kaca penutup terletak di atas kaca obyek. Jika masih ada gelembung udara ulangi pekerjaan tersebut sampai tidak ada gelembung udara. Amati preparat yang anda buat dibawah mikroskop dengan terlebih dahulu menggunakan perbesaran lemah (10×10), kalau sudah diketahui obyek yang akan diamati kemudian memakai perbesaran kuat (10×20 atau 10×40).